Genomac International, s.r.o.

Důležité informace ke vzorkům na sekvenování

Věnujte prosím velkou pozornost přípravě vzorků na sekvenování, neboť jejich špatná kvalita nebo nízká koncentrace je nejčastější příčinou selhání sekvenační reakce. Následující informace by měly napomoci k co nejlepším výsledkům sekvenace.

1) Koncentrace a objem vzorků
Do sekvenační reakce je zapotřebí podstatně více vstupního množství templátu než do PCR reakce. V tabulce jsou uvedeny minimální koncentrace a objemy vzorků a primerů potřebné pro jednu obousměrnou sekvenaci. Nevadí, pokud budou vzorky koncentrovanější (naředíme si je), problém nastává, když je vzorku nedostatek. V případě, že vzorky přečiš?ujete (PCR produkty po PCR reakci), provádějte odečet jejich koncentrace až po jejich přečištění (při purifikaci často dochází ke ztrátám).
Koncentraci doporučujeme určovat na základě odečtu z gelové elektroforézy srovnáním se známým standardem o srovnatelné velikosti (koncentrace naměřená pomocí spektrofotometru nemusí vždy odpovídat skutečnosti). Koncentraci určete pokud možno co nejpřesněji, z těchto údajů pak budeme vycházet při přípravě sekvenační reakce.

Tab. 1 Minimální množství vzorků a primerů potřebných pro jednu obousměrnou sekvenaci

Materiál   Min. koncentrace Min. objem
Plazmid   0,2ug/ul 20ul
PCR produkt o velikosti 80 – 250bp 15ng/ul 10ul
  o velikosti 250 – 600bp 25ng/ul 10ul
  o velikosti 600 – 1200bp 50ng/ul 10ul
  o velikosti > 1200bp 50ng/ul 20ul
Primer   10pmol/ul 10ul

2) Kvalita vzorků
Přítomnost vedlejších produktů, prázdných vektorů, RNA, proteinů nebo jiných nečistot výrazně zhoršuje kvalitu sekvenování. V takovém případě je vhodné vzorky přečistit nebo změnit podmínky PCR reakce. Po purifikaci PCR produktů nebo izolaci plazmidů vzorky rozpouštějte vždy ve vodě, nikoliv v pufru.

3) Počet vzorků
Minimální počet vzorků dodaných k sekvenaci je u obousměrné sekvenace 5 a u jednosměrné sekvenace 10. Při nižším počtu vzorků bude celková fakturovaná částka 5 000,- Kč + 20% DPH a to nezávisle na aktuálním počtu vzorků.

4) Dodání vzorků
K sekvenování nám dodejte:
1) vzorky a primery v 1,5 nebo 0,5ml dobře zaizolovaných netenkostěnných mikrozkumavkách
2) pečlivě vyplněnou průvodku
3) fotografii gelu se vzorky a velikostním standardem, kde jsou uvedeny objemy nanesených vzorků a standardu a dále název a výrobce standardu
Vše zašlete na adresu Genomac, Bavorská 856, 155 41 Praha 5 - Stodůlky nebo po předchozí telefonické domluvě dodejte osobně.

5) Další informace
- vzorky a primery označte co nejjednodušeji
- pokud víte nebo tušíte, že Váš vzorek obsahuje některá hůře sekvenovatelná místa (úseky bohaté na GC nebo AT, dlouhé repeaty, dlouhé homopolymerní úseky apod.), upozorněte nás na to
- pokud je nízká výtěžnost PCR reakce v důsledku horšího nasedání primerů a je tedy zapotřebí do reakce přidávat mnohem větší množství primerů (např.100pmol a více), upozorněte nás na to
- u prvních 50 bazí nezaručujeme čitelnost sekvence (pozor při navrhování primerů)
- termín dodání výsledků je zpravidla 14 dní
- za dostatečnou koncetraci a kvalitu vzorků zodpovídá zákazník a při analýzách vycházíme z údajů uvedených v průvodce
- v krajních případech (neúplně nebo nesprávně vyplněná průvodka, objem vzorku nebo primeru výrazně neodpovídá uvedeným hodnotám, vzorky nejsou detekovatelné na gelové elektroforéze apod.) řešíme tuto situaci se zákazníkem a v takovém případě účtujeme 300 – 1000 Kč v závislosti na komplikovanosti případu, nákladech atd.




NAROHU