Laboratorní příručka

Vedoucí laboratoře: RNDr. Lucie Benešová, Ph.D. …………………………..

OBSAH

1. Úvod. 3

2. Základní informace o laboratoři 4

2.1. Identifikace laboratoře. 4

2.2. Zaměření laboratoře a spektrum nabízených služeb. 5

2.3. Vnitřní členění laboratoře. 5

2.4. Spektrum nabízených služeb. 6

3. Preanalytická fáze. 7

3.1. Odběry vzorků mimo Laboratoř Genomac. 7

3.2. Odběry vzorků v Laboratoři Genomac. 8

3.3 Příjem primárních vzorků. 8

3.4 Doprovodné listy ke vzorkům.. 8

3.5 Přezkoumání přijatého vzorku. 9

3.6 Odmítnutí vzorků pro zpracování 10

3.7 Dodatečné požadavky na vyšetření 10

3.8 Skladování vzorků po jejich přijetí 10

3.9 Vyšetřování ve smluvních a spolupracujících laboratořích. 10

4 Postanalytická fáze. 10

4.1 Vydávání výsledků. 10

4.2 Telefonické hlášení výsledků. 12

4.3 Komunikace s laboratoří 12

5 Seznam jednotlivých vyšetření 13

5.1 Izolace nukleové kyseliny. 13

5.2 Klinická diagnostika. 13

5.3 Forenzní diagnostika. 21

6. Seznam změn. 23

7. Seznam revizí 23

8. Přílohy. 23

1. Úvod

Cílem dokumentu je informovat lékaře a žadatele o laboratorní vyšetření o nabídce služeb Laboratoře molekulární genetiky a onkologie Genomac (dále jen Laboratoř Genomac). Laboratorní příručka je určena zejména lékařům, zdravotním sestrám a potencnálním klientům, jako přehledný zdroj informací o laboratoři, popisuje preanalytické fáze a postanalytické fáze laboratorního vyšetření (zásady odběru, způsob požadování vyšetření a vydávání výsledků, spektrum laboratorních vyšetření, vydávání výsledků atd.).

Laboratorní příručka je součástí řízené dokumentace laboratoře, je pravidelně aktualizována a žadatelům o vyšetření je k dispozici na webových stránkách laboratoře – www.genomac.cz.

Laboratorní příručka je připravena v souladu s normou ČSN EN ISO 15189:2013.

2. Základní informace o laboratoři

2.1. Identifikace laboratoře

Název organizace: Genomac výzkumný ústav, s.r.o.

Adresa pracoviště: Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac

Drnovská 1112/60

161 00 Praha 6 – Ruzyně

Identifikační údaje: IČO: 26475821

DIČ: CZ26475821

Provozní doba: Pondělí – Pátek 8:00 – 18:00

Příjem vzorků: Pondělí – Pátek 8:00 – 16:30

Odběr vzorků: Úterý a Čtvrtek 8:30 – 16:30

Ředitel společnosti: RNDr. Marek Minárik, Ph.D.

Tel: +420 737 455 711

Email: mminarik@genomac.cz

Vedoucí laboratoře: RNDr. Lucie Benešová, Ph.D.

Tel: +420 603 501 850

Email: lbenesova@genomac.cz

2.2. Zaměření laboratoře a spektrum nabízených služeb

Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac byla založena v rámci společnosti Genomac v roce 2001 a od svého vzniku se zaměřuje na testování DNA a aplikovaný výzkum v oblasti molekulární onkologie, vyšetřování geneticky podmíněných onemocnění a určování otcovství. V roce 2006 byl společnosti udělen statut Nestátního zdravotnického zařízení a v roce 2007 statut Znaleckého ústavu pro obor zdravotnictví s rozsahem oprávnění pro genetiku a analýzy DNA včetně určování genetické identity je zapsána do I. oddílu seznamu znaleckých ústavů při Ministerstvu Spravedlnosti ČR. Laboratoř se každý rok účastní mezinárodních kontrol kvality (EMQN, EQA) a kontrol kvality v České republice.

2.3. Vnitřní členění laboratoře

Laboratoř je rozdělena na 4 úseky (STR genotypizace, Klinická diagnostika, Věda a Výzkum a administrativa). Každý úsek má svého vedoucího zaměstnance a nad nimi stojí vedoucí laboratoře.

Seznam odborných pracovníků:

RNDr. Marek Minárik, Ph.D.: ředitel
soudní znalec

RNDr. Lucie Benešová, Ph.D: ředitelka pro výzkum a služby

vedoucí laboratoře

VŠ odborný pracovník s registrací a specializací Vyšetřovací metody v lékařské genetice – molekulární genetika

soudní znalec

Bc. Barbora Belšánová: Odborný pracovník s registrací a specializací v oboru klinická genetika , metrolog, manažer kvality

Doc. MUDr. Lenka Foretová, Ph.D: lékař

klinický genetik s atestací

Mgr. Tereza Hálková: laboratorní pracovník pod odborným dohledem

Ostatní laboratorní personál

Pracovníci laboratoře nakládají s osobními údaji pacientů podle předpisu číslo 372/2011 sb. – zákon o zdravotních službách a jejich poskytování, a to podle paragrafu 51 o zachování mlčenlivosti a podle paragrafu 65 o nahlížení do zdravotnické dokumentace.

2.4. Spektrum nabízených služeb

Laboratoř je zaměřena na molekulárně-genetické analýzy včetně odpovídající interpretace. Molekulárně-genetická vyšetření jsou prováděna citlivými laboratorními metodami na principu DNA analýz. Služby laboratoře jsou navrženy tak, aby splňovaly potřeby klientů a lékařů.

Laboratoř poskytuje tato vyšetření:

Izolace nukleových kyselin (DNA)

Izolace DNA

Klinická diagnostika

a) Detekce vrozených mutací/polymorfismů

Factor V Leiden (G1691A)^(EQC)

Factor II prothrombin (G20210A)^(EQC)

MTHFR (C677T)^(EQC), (A1298C)^(EQC)

PAI-1 (4G/5G)

ApoB (R3500Q)^(EQC)

LDLR (D245E)

HFE (C282Y), (H63D), (S65C)

AAT (E264V)^(EQC) ,(E342K)^(EQC)

LTC (-T13910C)

CFTR (F508del)^(EQC), CFTRdele2.3(21kb)^(EQC), (G551D)^(EQC), (G542X)^(EQC), (N1303K)^(EQC), (1898+1G>A)^(EQC), (2143delT)^(EQC), (2184insA)^(EQC), (R347P)^(EQC), (W1282X)^(EQC), (R553X)^(EQC)

PAH (R408W)^(EQC)

CYP2C9 (C430T), (A1075C)

VKORC (1173 C>T), (-1639 G>A)

b) Detekce somatických mutací

EGFR (exon 19 a 21)^(EQC)

KRAS(exon 1)^(EQC)

Forenzní diagnostika

Určování otcovství, identity či příbuznosti na základě analýzy STR markerů včetně vypracování znaleckého posudku

Rozšíření již vyhotovených znaleckých posudků, popř. odborných vyjádření v rozsahu znaleckého oprávnění

3. Preanalytická fáze

3.1. Odběry vzorků mimo Laboratoř Genomac

Před odběrem lékařem musí být klient řádně informován o důvodu a průběhu genetického vyšetření a s tímto vyšetřením souhlasit, což stvrzuje svým podpisem na informovaném souhlasu (viz příloha č.1).Stav pacienta, klienta, vlastní odběr materiálu, jeho transport do laboratoře, uchovávání a další manipulace se vzorkem před analýzou mohou ovlivnit konečný výsledek analýzy. Podrobné podmínky pro odběr, skladování a přepravu vzorků do Laboratoře Genomac jsou popsány v kapitole 5 u jednotlivých typů vyšetření. Obecně však platí, že vzorky standardně přijímané do laboratoře k následnému zpracování jsou:

- DNA

- čerstvá tkáň, bukální stěr, krev, krev odebraná do speciálních transportních zkumavek

- archivovaná tkáň ve formě parafínových bločků či řezů, buněčný nátěr na cytologickém skle, FTA karta

Ostatní typy vzorků jsou přijímány pouze po předchozí domluvě s vedoucí laboratoře. Vzorky jsou do laboratoře dodávány poštou, kurýrem nebo jinou transportní službou, sanitárním vozem vypraveným odesílajícím zdravotním zařízením a osobně klientem, lékařem či pracovníkem laboratoře.

Vzorky musí být do laboratoře dodány v takovém obalu, aby bylo maximálně zamezeno jejich poškození nebo vytečení. Doporučujeme uložení vzorků v plastových (PE) zkumavkách (DNA, tkáň, krev, bukální stěry) nebo krabičkách (archivované vzorky) a při dopravě poštou nebo kurýrem vložení do bublinkové nebo jinak vyztužené obálky či chladící nádoby.

DNA izolovaná z různých materiálů a rozpuštěná v TE pufru nebo ve sterilní vodě může být skladována krátkodobě při 4°C a dlouhodobě při -18 až -24 °C. Vzorky DNA musí být dopravovány v chlazené nádobě. Krev, bukální stěr nebo čerstvou tkáň je třeba po odběru skladovat při 4–8 °C po dobu maximálně jednoho dne. Pokud se předpokládá delší uskladnění před odesláním do laboratoře, je třeba odebraný biologický materiál uchovávat při -18 až -80°C. Vzorky krve a čerstvé tkáně musí být dopravovány do laboratoře v chlazené nádobě.

Archivovaný biologický materiál (fixovaná tkáň v parafínovém bločku nebo řezu, buněčný nátěr na cytologickém skle, FTA karta) lze uchovávat při laboratorní nebo pokojové teplotě a za stejných podmínek i transportovat do laboratoře.

Každý vzorek biologického materiálu je považován za potenciálně infekční, proto je po odběru nutné zamezit jeho možnému kontaktu s pacienty i veřejností. Svoz vzorků musí být zajišťován v uzavřených nádobách či boxech tak, aby během transportu nedošlo ke kontaminaci osob nebo dopravních prostředků použitých k přepravě. V případě rozlití je třeba se řídit platnými zásadami dezinfekce a dekontaminace.

3.2. Odběry vzorků v Laboratoři Genomac

V případě forenzních analýz za účelem vypracování znaleckého posudku a na žádost klienta u vyšetření v rámci klinické diagnostiky provádí odběr biologického materiálu (bukálních stěrů) pracovníci Laboratoře Genomac. Tento odběr probíhá po předchozím sjednání termínu s odpovědným pracovníkem v odběrové místnosti a provádí se pomocí sterilních stěrových štětečků.

3.3 Příjem primárních vzorků

Všechen materiál je do laboratoře Genomac přijímán během provozní doby 8:00 – 18:00 hod, v případě telefonické domluvy i mimo pracovní dobu. Vzorky mohou být dodané poštou, kurýrem, sanitárním vozem nebo osobně a jsou přejímány pracovníkem laboratoře, který vzorky předá do laboratoře kompetentním osobám. Nedílnou součástí přijímaného vzorku je doprovodný list

3.4 Doprovodné listy ke vzorkům

Nedílnou součástí přijímaného vzorku je doprovodný list. Základními doprovodnými listy k vyšetřením zadávaným lékaři jsou žádanky vydávané Laboratoří Genomac (příloha č.2) a žádanky laboratoře LFG Brno (příloha č. 3), a dále jiný druh žádanek v případě, že splňují dané náležitosti vyplněné lékařem:

- identifikace pacienta - jméno, příjmení, číslo pojištěnce

- číslo pojišťovny (pouze v případě hrazení ZP)

- jméno lékaře (žadatele o vyšetření), adresa ambulance

- identifikační číslo zařízení

- odbornost indikujícího lékaře

- soupis požadovaných vyšetření

- klinické informace o pacientovi (hlavní klinická diagnóza a případné vedlejší diagnózy)

- datum a čas odběru primárního vzorku

Doprovodnými listy ke vzorkům přijímaným k vyšetřením v rámci klinické diagnostiky od klientů samoplátců nebo k forenzním vyšetřením jsou Průvodky ke vzorkům vydávané Laboratoří Genomac obsahující tyto nezbytné náležitosti:

- identifikační údaje zadavatele zvoleného testu

- identifikační údaje tetované osoby

- kontakt pro předání výsledků

- heslo pro komunikaci a vydání výsledků

- podrobný informovaný souhlas testované osoby nebo jejího zákonného zástupce

3.5 Přezkoumání přijatého vzorku

Biologický materiál je při příjmu přezkoumán pracovníky laboratoře společně s doprovodným listem. Účelem této kontroly je zajistit, aby se k dalšímu zpracování nedostal žádný biologický vzorek, k němuž není připojena řádně vyplněná žádanka nebo průvodka ke vzorku nebo nebo jinak nevyhovující vzorek. Jednotlivé kroky přezkoumání jsou následující:

- přiřazení biologického materiálu k žádance nebo průvodce ke vzorkům dle identifikačních údajů uvedených na obalu vzorku (zkumavce, mikroskopickém skle, parafínovém bločku apod.)

- posouzení kvality biologického materiálu na základě kontroly nepoškozenosti obalu vzorku (zkumavka, krabička), vzhledu vzorku (konzistence, způsob fixace, zabarvení atd.) a jeho množství (objem, velikost)

- kontrola správného, čitelného a kompletního vyplnění doprovodného listu (žádanky nebo průvodky ke vzorkům) dle bodu 3.2. včetně všech požadovaných podpisů

Potvrzením shody s požadavky je přidělení identifikačního čísla danému vzorku a jeho zanesení do elektronické evidence vzorků.

3.6 Odmítnutí vzorků pro zpracování

V případě zjištění neshody v některém z kroků uvedených v kapitole 3.5 laboratoř vzorek nezpracovává, vyzve e-mailem, poštou či telefonicky zasílající osobu k nápravě a s dalším zpracováním vzorku čeká, dokud nejsou potřebné informace či dokumenty nebo nový vzorek dodány .

3.7 Dodatečné požadavky na vyšetření

Lékař nebo klient může doobjednat další vyšetření. Podmínkou je dostatečné množství a kvalita vyšetřovaného biologického materiálu a dodání nového doprovodného listu s dodatečnými požadavky na vyšetření.

3.8 Skladování vzorků po jejich přijetí

Vzorky jsou laboratoří zpracovávány postupně s ohledem na typ vyšetření respektive urgentnost konkrétních případů. Před zahájením zpracování jsou vzorky typu DNA, čerstvá tkáň, bukální stěr, krev apod. uchovávány krátkodobě (do 1 dne) v lednici při teplotě 4-8°C, při delším skladování v mrazicím boxu při teplotě -18 až -80°C. Archivované vzorky se uchovávají při laboratorní teplotě.

3.9 Vyšetřování ve smluvních a spolupracujících laboratořích

Laboratoř Genomac nemá smluvní a spolupracující laboratoře.

4 Postanalytická fáze

4.1 Vydávání výsledků

Laboratoř vydává výsledky ve formě výsledkové zprávy nebo telefonicky a to výhradně té osobě, která je v doprovodném listu uvedena jako kontakt pro předání výsledků. Výsledková zpráva je vždy připravena v tištěné formě a předaná dle požadavků lékaře či klienta (v tištěné formě, elektronicky nebo osobně). Výsledková zpráva je zasílána vždy v tištěné formě zadávajícímu lékaři. Předání výsledků e-mailem nebo osobně je pouze na základě zadání hesla uvedeného v průvodce ke vzorkům. Před vydáním výsledkové zprávy jsou výsledky zkontrolovány a uvolněny oprávněnou osobou včetně její autorizace.

Výsledkové zprávy u vyšetření zadávaných lékařem musí vždy obsahovat:

- identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

- identifikaci pacienta (jméno a příjmení, číslo pojištěnce nebo rok narození)

- identifikaci žadatele (jméno, adresa, IČP )

- datum a čas odběru primárního vzorku

- datum a čas příjmu vzorků

- diagnózu pacienta

- výsledek vyšetření

- druh dodaného biologického materiálu

- slovní komentář, v případě nutnosti slovní interpretaci

- datum vydání výsledkové zprávy

- identifikaci pracovníka zodpovídajícího za analýzu

- identifikace pracovníka uvolňujícího výsledkovou zprávu

Akreditované vyšetření je na výsledkové zprávě označeno symbolem *.

Vzor výsledkové zprávy je přílohou č. 4 tohoto dokumentu.

Ostatní výsledkové zprávy obsahují:

- identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

- identifikaci testovaného vzorku (jméno a příjmení nebo evidenční číslo vzorku)

- datum příjmu vzorků

- název zadaného testu

- výsledek vyšetření

- druh dodaného biologického materiálu

- slovní komentář, v případě nutnosti slovní interpretaci

- datum vydání výsledkové zprávy

- identifikaci pracovníka zodpovídajícího za analýzu

- identifikace pracovníka uvolňujícího výsledkovou zprávu

Výsledkové zprávy ve formě znaleckých posudků obsahují všechny náležitosti dle Zákona o znalcích a tlumočnících 36/1967 Sb.

4.2 Telefonické hlášení výsledků

Výsledky se sdělují telefonicky v případě, že si o toto zadavatel (lékař, klient) zažádal v doprovodném listu nebo po předchozí domluvě s vedoucí laboratoře. Zadavatel (lékař, klient) je telefonicky ověřován pomocí specifického údaje uvedeného na doprovodném listu. V případě lékaře se ověřuje pomocí IČZ, v případě klienta se ověřuje pomocí hesla. Oznámení o hlášení výsledků v rámci akreditovaných vyšetření se zapisuje do knihy (Záznam o telefonických hlášeních), který obsahuje: datum, čas, jméno odpovědného pracovníka laboratoře, jméno příjemce zprávy a výsledky vyšetření. Výsledek je pak zaslán ještě v tištěné podobě.

4.3 Komunikace s laboratoří

Stížnosti

Laboratoř se snaží minimalizovat nedostatky a neshody ve své práci. Vyřizování stížností je věcí vedoucího laboratoře a ředitele zařízení. Drobné připomínky okamžitě řeší kterýkoliv pracovník laboratoře a následně o tom informuje svého nadřízeného. V případě oficiální písemné stížnosti je tato prošetřena vedením laboratoře a v co nejkratší době vyřízena, což se vyjádří formou písemného záznamu. Tento záznam je uložen a archivován v dokumentech laboratoře.

Konzultace

Laboratoř poskytuje poradenské služby, které vyřizuje vedoucí laboratoře nebo odpovědný pracovník telefonicky nebo e-mailem. Taktéž vyřizuje konzultace a případné dotazy zadavatelů vyšetření.

5 Seznam jednotlivých vyšetření

5.1 Izolace nukleové kyseliny

Popis:

Izolace nukleových kyselin (DNA) je výchozí krok, který je podstatný pro všechna následná laboratorní vyšetření. Provádí se pomocí komerčních kitů. Kvalita a kvantita se stanovuje pomocí gelové elektroforézy nebo spektrofotometricky.

Materiál pro izolaci DNA:

- periferní krev

- archivované preparáty (cytologické sklíčko, parafínový bloček)

- nativní tkáň

- bukální stěr

- plazma

5.2 Klinická diagnostika

Detekce vrozených mutací/polymorfismů

Popis vyšetřovaných mutací:

Factor V Leiden (G1691A)^(EQC)

Jedná se o nejvýznamnější a zároveň nejzávažnější doposud identifikovanou mutaci souvislosti s geneticky podmíněným vznikem trombózy. V řetězci DNA je na pozici 1691 změněno G a A a v peptidickém řetězci je arginin změněn za glutamin (Arg506Gln). Tato změna vyvolává rezistenci proti aktivovanému proteinu C (APC), který je důležitým inhibitorem koagulace.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

Factor II Prothrombin (G20210A)^(EQC)

Jedná se o mutaci v genu pro protrombin (faktor II krevního srážení), která mění na pozici 20210 ve 3´nepřekládané oblasti G za A. Mutace vyvolává zvýšenou produkci protrombinu a tím i větší náchylnost ke srážení krve.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

MTHFR (C677T, A1298C)^(EQC)

Enzym MTHFR (methylentetrahydrofolát reduktáza) je nepostradatelnou součástí metabolismu kyseliny listové a dalších pro organizmus důležitých látek, ale jeho klíčovou úlohou je přeměna aminokyselin homocysteinu na methionin. Nedostatek enzymu nebo jeho snížená funkce je příčinou hromadění homocysteinu v krevní plazmě, což může vést k poruchám srážlivosti krve, vzniku krevních sraženin, k některým onemocněním kardiovaskulárního systému a komplikacím v těhotenství. V genu MTHFR byly popsány dvě poměrně časté mutace, které kódují výsledný protein s nižší aktivitou, a to C677T a A1298C. Častější a známější je substituce C za T v pozici 677, kdy v peptidickém řetězci na pozici 223 se mění alanin za valin. Při přítomnosti této mutace dochází ke snížení aktivity enzymu MTHFR u homozygotu až na 30%, Druhou častou mutací je substituce A za C v pozici 1298, kdy v peptidickém řetězci na pozici 429 se mění kyselina glutamová za alanin. Tato mutace sama o sobě nemá vliv na snížení aktivity MTHFR pouze v kombinaci s mutací C677T.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

PAI-1 (4G/5G)

Protein PAI-1 je inhibitor aktivátoru plazminogenu (plazminogen je součástí kaskády plazmolýzy, což je rozpouštění krevní sraženiny) a vyskytuje se ve výstelce cév a při graviditě v děložní sliznici. Existují dvě varianty a to nemutantní varianta 5G a mutantní varianta (4G), kdy 4G způsobuje výskyt vyšší hladiny tohoto proteinu. A výsledkem je zvýšené množství trombů, což zejména v těhotenství vede k vyššímu riziku těhotenských komplikací, cévních onemocnění placenty, poruchy růstu plodu, předčasných porodů a spontánních potratů. Všeobecně uváděné riziko spontánního potratu je asi 10-11% všech těhotenství. Pro nositelky genotypu 4G/4G dosahuje toto riziko až 38%.

Referenční hodnoty:

5G/5G = Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; + / +; O/O

4G/5G = Heterozygot - heterozygot = wt / mut; + / -; X/O

4G/4G = Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/O

ApoB (R3500Q)^(EQC) a LDLR (D245E)

Familiární hypercholesterolemie (FH) je dědičně podmíněné metabolické onemocnění způsobené mutacemi v genu pro LDL receptor. Jedná se o mutaci D245E.

Druhá mutace R3500Q způsobuje Familiární defekt apolipoproteinu B100 (FDB), což je dědičně podmíněné metabolické onemocnění způsobené mutacemi v genu pro apolipoprotein B100.

Důsledkem obou uvedených onemocnění je zhoršené vychytávání LDL-cholesterolu („zlý“ cholesterol) z krve. Nadbytečný cholesterol se ukládá ve stěně cév a významně přispívá k rozvoji aterosklerózy (kornatění cév) a následným komplikacím, jako je např. infarkt myokardu nebo cévní mozkové příhody v poměrně mladém věku.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

HFE (C282Y, H63D, S65C)

Hemochromatóza je dědičné onemocnění charakteristické nadměrným vstřebáváním železa z trávicího traktu a jeho následným ukládáním v různých orgánech (játra, slinivka břišní, srdeční svalovina, kůže, pohlavní žlázy).

Nejčastější mutace spojované s hemochromatózou jsou C282Y a H63D. U první mutace dochází na 282 pozici k záměně cysteinu za tyrosin a ve druhém případě dochází na 63 pozici k záměně histidinu za kyselinu asparagovou. 80% osob trpících příznaky hemochrozmátozy jsou nosiči homozygotní formy mutace C282Y. S druhou mutací H63D jsou spojovány spíše mírnější formy hemochromatózy. O to vážnější je průběh hemochromátózy dvojtého heterozygota C282Y a H63D. Další mutací spíše s méně dramatickou formou hemochromatózy je spojovaná mutace S65C.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

AAT (E264V, E342K)^(EQC)

Deficit enzymu alfa-1-antitrypsinu (dále jen AAT) je vážné a relativně časté dědičné onemocnění. Deficit enzymu AAT vzniká na základě vrozených mutací E264V a E342K v DNA, které se mohou vyskytovat v jedné nebo obou kopiích genu AAT a je charakterizován nízkými hladinami enzymu AAT v krvi. Hlavní funkce AAT v těle je vázat a tím inaktivovat jiný enzym – elastázu, která je zodpovědná za degradaci neboli odbourávání buněk i celých tkání. Nízká hladina AAT vede k nerovnováze mezi oběma enzymy a tím jednak k hromadění elastázy v plicích a jejich degradaci a jednak k hromadění AAT v játrech a to vede k poškození plicní a jaterní tkáně.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

LTC (-T13910C)

Laktózová intolerance je částečná nebo úplná neschopnost trávicího traktu zpracovat laktózu, což je mléčný cukr, obsažený v nezpracovaných mléčných výrobcích. Lidský organismus totiž není schopen laktózu z mléka vstřebat přímo a musí ji nejdříve pomocí enzymu laktázy rozštěpit na menší části. Právě nedostatečné množství tohoto enzymu bývá příčinou laktózové intolerance. Gen LCT, který kóduje enzym laktázu, kontrolní mechanizmy exprese tohoto genu jsou spojovány s polymorfismem (-13910 C/T).

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

CFTR (F508del, dele2.3(21kb), G551D, G542X, N1303K, 1898+1G>A, 2143delT, 2184insA, R347P, W1282X, R553X)^(EQC)

Cystická fibróza je nejčastější fatální autozomálně recesivní genetická porucha u dětí, s incidencí 1 na 2500 narozených a frekvencí přenašečů asi 1 na 25. Toto chronické onemocnění postihuje hlavně plíce a exokrinní pankreas. Gen CFTR je na chromozómu 7q31 a jeho velikost je asi 250kb. 27 exonů kóduje velký integrální membránový protein o velikosti 17kD, který řídí tok chloridových iontů přes membránu, v případě poškození tohoto proteinu se stává kanál nepropustný pro chloridové ionty a tím dochází ke změně složení hlenu na povrchu buněk a zvyšování hustoty hlenu. U nemocných pacientů bylo v tomto genu nalezeno více jak 1000 mutací, ale nejrozšířenější mutací je F508del, která se vyskytuje u cca 70% nemocných.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

PAH (R408W)^(EQC)

Fenylketonurie je to autozomálně recesivní genetické metabolické onemocnění způsobené mutacemi v genu pro enzym fenylalaninhydroxylázu. Důsledkem je neschopnost organismu odbourávat fenylalanin, který se následně hromadí v krvi a tkáních, což je ve vyšších koncentracích pro organismus toxické.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

CYP2C9 (C430T, A1075C) a VKORC (1173 C>T, -1639 G>A)

Gen CYP2C9, lokalizován na chromozomu 10 10q24 a kóduje enzym cytochrom P450 monooxygenáza, který katalyzuje reakce související s metabolismem léků a syntézou cholesterolu, steroidů a jiných lipidů. Protein je lokalizován v endoplazmatickém retlikulu a jeho exprese je indukovaná rifampinem, který je součástí některých léků. Cytochrom P450 je známým metabolizátorem většiny xenobiotik, ibuprofenu a warfarinu. Nejčastěji se vyskytujícími variantami jsou C430T a A1075C, po zjištění genotypu těchto dvou variant se předepíše správné množství léku vhodného pro pacienta, tak aby metabolismus léku byl vyvážený a lék správně působil.

Gen VKORC kódující vitamín K reduktázový komplex, jehož úkolem je přeměna vitamínu K na jeho aktivní formu. Vitamín K je důležitým prvkem účastnícím se karboxylace faktorů II, VII, IX, X, které jsou důležití v koagulační kaskádě (tzv. vitamín K dependentní faktory). Léky jako warfarin a jiné kumaríny blokují gen VKORC a tím tedy aktivaci Vitamínu K. Nejznámějšími polymorfismy v genu VKORC jsou (1173 C>T), (-1639 G>A), mezi těmito polymorfismy byla prokázána těsná vazba a postačuje identifikace pouze jednoho. Spousta odborných studií poukazuje na to, že pacientům s variantou GA u polymorfismu 1639 hrozí 2,3x a s variantou AA 10x vyšší riziko předávkování kumariny.

Referenční hodnoty:

Negativní= nemutovaný homozygot = wild type = wt / wt; O/O

Heterozygot - heterozygot = wt / mut; X/O

Homozygot - mutovaný homozygot = mut / mut; X/X

Metodika: Specifická PCR s tvorbou heteroduplexů a následnou detekcí pomocí denaturační kapilární elektroforézy

Biologický materiál:

- nesrážlivá periferní krev

- bukální stěr

Odběr a skladování:

- periferní krev: odebrat do zkumavky s protisrážlivým činidlem K₃EDTA nebo citrátem sodným, objem cca 2 ml

- bukální stěr: půl hodiny před odběrem nejíst, nepít, nekouřit, nevyplachovat ústa, na odběr použít speciální sterilní štětečky dodávané Laboratoří Genomac

- odběry není třeba provádět nalačno

- skladovat při 4–8 °C do jednoho dne, při delším skladování vzorek skladovat při teplotě -18 až -80°C

Provádí se: 1x týdně

Doba odezvy od dodání vzorku: 10 pracovních dnů

Detekce somatických mutací

Popis vyšetřovaných mutací:

EGFR (exon 19, 20 a 21)^(EQC)

Gen EGFR je lokalizován do oblasti chromozomu 7p12 a skládá se z 28 exonů. Jeho proteinový produkt je receptor pro epidermální růstový faktor (Egfr, Her1 nebo ErbB1) jehož hlavní funkcí je stimulace buněčné proliferace, diferenciace, přežívání, angiogeneze a migrace. Egfr je důležitým proteinem pro udržování normální buněčné funkce a pro přežití. Při deregulaci Egfr signální dráhy dochází k vývoji maligního procesu v důsledku aktivace buněčného cyklu, inhibice apoptózy, indukce angiogeneze, pohybu nádorových buněk a metastazování.

Aktivace Egfr nastává po navázání ligandu na extracelulární část proteinu. Po vazbě ligandu receptor vytváří homo nebo heterodimer s dalším receptorem z rodiny ErbB, pak následuje autofosforylace receptoru přenesením fosfátu z ATP a nakonec dochází fosforylací některého z adaptérových proteinů.

Mutace, které se vyskytují v nádorových buňkách, jsou lokalizovány v exonech 18 - 21 genu EGFR, což je oblast kódující tyrozin kinázovou doménu, kde dochází k vazbě ATP. Téměř 90% těchto mutací představují delece v exonu 19 a substituce L858R v exonu 21.

Přítomnost těchto mutací je pozitivním prediktivním faktorem při cílené biologické léčbě tyrozin kinázovými inhibitory (gefitinib, erlotinib) a základní podmínkou pro nasazení léčby gefitinibem v první linii. Přítomnost mutace T790M v exonu 20 je považována za rezistentní mutaci k léčbě první generace inhibitorů TKI (gefitinib, erlotinib). Zároveň je tato mutace pozitivním prediktorem cílené léčby inhibitory druhé generace TKI (např. afatinib) nebo třetí generace TKI (např. osimertinib).

Referenční hodnoty:

Negativní = nemutované buňky = wild type = wt; O

Pozitivní = mutované buňky = mut; X

KRAS(exon 2, 3, 4)^(EQC)

Gen KRAS leží v oblasti chromozómu 12p12.1 a obsahuje 6 exonů. Jeho produktem je Ras neboli p21 protein. Jde o malý GTP-vazebný protein lokalizovaný na vnitřní straně plazmatické membrány, který přenáší prostřednictvím transdukčních dráh do jádra signály stimulující buněčný růst nebo inhibující apoptózu. Tento protein se vyskytuje ve dvou stavech - v inaktivním stavu ve vazbě s GDP a v aktivním stavu ve vazbě s GTP. Ve fyziologických podmínkách je Ras v inaktivním stavu. Aktivace Ras proteinu nastává působením extracelulárních signálů (např. růstových faktorů, cytokinů nebo signálů pro adhezi) prostřednictvím specifických povrchových receptorů. Po navázání signální molekuly na receptor dojde k jeho autofosforylaci, dimerizaci a následné vazbě dalších proteinů. To vede k přechodu Ras do aktivního stavu. Ten pak zahajuje některou z transdukčních drah Ras/Raf, Ras/PI3-K, Ras/Ral nebo Ras/PLC.

Mutace v KRAS genu detekované v nádorových buňkách způsobují permanentní aktivaci proteinu a k rozsáhlé interakci s různými efektory. Tím se role mutovaného Ras proteinu stává v postižených buňkách mnohem komplexnější a kvantitativně rozdílná než funkce Ras ve zdravých buňkách a umožňuje nekontrolovaný růst a nádorovou transformaci. Ve většině případů jde o jednonukleotidové mutace v kodonech 12 a 13 (exon 2), 59 a 61 (exon 3), 117 a 146 (exon 4). Bylo ukázáno, že konkrétní typ a pozice mutace může mít vliv na prognózu, průběh onemocnění nebo odpověď na léčbu. Vyšetření KRAS negativity (prokázaní exklusivní přítomnosti divoké alely) je základní podmínkou pro nasazení schémat obsahujících cetuximab nebo panitumumab.

Referenční hodnoty:

Negativní = nemutované buňky = wild type = wt; O

Pozitivní = mutované buňky = mut; X

Metodika: Specifická PCR s tvorbou heteroduplexů s následnou detekcí pomocí denaturační kapilární elektroforézy

Biologický materiál:

- nativní zmražená tkáň

- archivovaná tkáň ve formě parafínových bločků či řezů

- buněčný nátěr na cytologickém skle

- periferní krev

Odběr a skladování:

Tkáň nebo buňky odebrané při endoskopickém vyšetření nebo operaci

- nativní tkáň: ihned po odběru uchovávat v plastové zkumavce při teplotě -18°C až -80°C, transport do laboratoře v chladící nádobě

- parafínové bločky: standardní zpracování, fixou označit oblast nádorové tkáně, transport do laboratoře při pokojové teplotě

- buněčné nátěry: barvení coomasie blue, nezalévat do epoxidu!!!, fixou označit oblast nádorových buněk, transport do laboratoře při pokojové teplotě v pevném obalu chránícím skla proti rozbití

Periferní krev

odběr do speciálních odběrových zkumavek, které k tomu naše laboratoř zajišťuje a dodává.

Provádí se: 1x týdně

Doba odezvy od dodání vzorku: 10 pracovních dnů

5.3 Forenzní diagnostika

Stanovení DNA profilu – Určování otcovství, identity či příbuznosti

STR markery (amelogenin, D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, vWA, D8S1179, TPOX, FGA, D5S818, S13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D)

DNA profil se stanovuje pomocí tak zvaných STR markerů (short tandem repeat, česky: opakující se krátké repetice). Tyto STR markery jsou úseky DNA, které nemají pro člověka žádný význam a díky tomu jsou pro každého jedince vysoce variabilní. Proto jsou tyto markery využívány pro identifikaci osob, nebo stanovení pro příbuznost mezi jednotlivými osobami, protože každému potomkovi předá jednu alelu matka a druhou alelu otec. Pro dostatečně vypovídající hodnotu je nutné analyzovat alespoň 15 těchto STR markerů, plus amelogenin což je marker určující pohlaví jedince. K vyšetření jsou využívány komerčně vyráběné identifikační kity.

Referenční hodnoty:

allelic ladder – výrobcem dodávaná směs všech alel vyskytujících se v běžné populaci, ke
kterému jsou vztaženy alely detekované ve zkoumaném vzorku.

Standardní DNA – DNA o známých hodnotách alel jednotlivých markerů

Metodika: Specifická PCR s následnou fragmentační analýzou

Biologický materiál:

- bukální stěry

- nesrážlivá periferní krev

- nativní zmražená tkáň ze zemřelé osoby

- archivovaná tkáň ve formě parafínových bločků či řezů

- FTA karta

Odběr:

- bukální stěr: půl hodiny před odběrem nejíst, nepít, nekouřit, nevyplachovat ústa, na odběr použít speciální sterilní štětečky dodávané Laboratoří Genomac

- periferní krev: odebrat do zkumavky s protisrážlivým činidlem K₃EDTA nebo citrátem sodným, objem cca 2 ml, odběry není třeba provádět nalačno

- nativní tkáň: odebrat do plastové zkumavky

Skladování a transport:

- bukální stěr, periferní krev a nativní tkáň skladovat při 4–8 °C do jednoho dne, při delším skladování vzorek skladovat při teplotě -18 až -80°C a do laboratoře transportovat v chladící nádobě

- archivovaná tkáň a FTA karta: skladovat a transportovat při pokojové teplotě

Provádí se: 2x týdně

Doba odezvy od dodání vzorku: 5 pracovních dnů (bez znaleckého posudku)

Doba odezvy od dodání vzorku: 10 pracovních dnů

6. Seznam změn

č. změny	č. kapitoly	Popis změny	datum	schválil

7. Seznam revizí

Datum revize	status	datum příští revize	schválil

8. Přílohy

Příloha č. 1 Informovaný souhlas

Příloha č. 2 Žádanka Laboratoře Genomac

Příloha č. 3 Žádanka laboratoře LFG Brno

Příloha č. 4 Vzor výsledkového protokolu